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西方墨點法和SDS, 染色實驗

 

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1.  必要的設備、溶液以及試劑

2.  步驟

3. 附註

 

 

1. 必要的設備、溶液以及試劑

必要的設備:

  • 電泳相關設備
  • 電印跡相關設備
  • 搖臂或旋轉平台
  • X光薄膜
  • 適當比例的聚乙醯胺凝膠(使用預澆鑄為宜)
  • 轉印膜(例如PVDF的硝酸纖維素)

必要的溶液和試劑:

  • TBST (Tris-Buffered Saline/TWEEN®-20): 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (目錄編號 648310), 150 mM NaCl (目錄編號 567440), 0.05% TWEEN®-20 (目錄編號 655205)
  • TBST-milk: 內含5%非脂肪奶粉的TBST, 單株抗體專用; 內含10%非脂肪奶粉, 多株抗體專用; 儲存於4°C條件下< 1週
  • 分析緩衝液(化學發光偵測): 100 mM Diethanolamine, pH 10.0, 1 mM MgCl2 (目錄編號442615), 以及0.2%NaN3
  • 基質緩衝液(鹼性磷酸酶比色偵測): 100 mM Tris-HCl, pH 9.5 (目錄編號 648310), 100 mM NaCl (目錄編號 567440), 5 mM MgCl2 (目錄編號 442615)
  • 鹼性磷酸酶基質溶液: 每毫升基質溶液加入4 µl NBT (p-nitroblue tetrazolium, 目錄編號 484235) 並且混合; 加入4 µl BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 目錄編號 203788)並且再次混合; 30分鐘內使用完畢
  • 停止溶液: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 (目錄編號 648310), 5 mM EDTA (目錄編號 34103)
  • 承載緩衝液: 200 mM Tris-HCl, pH 6.8 (目錄編號 648310), 4% SDS (目錄編號 428015428016), 20% 丙三醇 (目錄編號 356350), 溴酚藍, 以及200 mM DTT (Cleland試劑, 目錄編號 233155) (注意: 唯有希望還原條件時方可加入DTT)
  • 電泳緩衝液(running buffer): 此步驟取決於使用的凝膠系統, 請遵守製造商的建議方式
  • 轉印緩衝液(transfer buffer): 此步驟取決於使用的凝膠系統、膜的種類等等, 請遵守製造商的建議方式
  • 蛋白質分子量標誌物 (目錄編號 69149,或69079)

2.  步驟

本實驗的各項設定與參數是針對利用鹼性磷酸酶次級共軛試劑的比色偵測法所撰寫。換句話說, 您可以使用西方墨點比色系統或者化學發光系統進行實驗。

  1. 以混合適當
    樣品體積以及等容積的承載緩衝液的方式製備SDS-PAGE樣品; 加熱到95°C持續5分鐘。
  2. 在膠體電泳設備中使用電泳緩衝液設定丙烯醯胺凝膠
  3. 將合適的分子量標誌物以及樣品裝入試管中, 並且施加電流分離蛋白質。
  4. 利用電轉印裝置將蛋白質從具丙烯醯胺凝膠中移轉到轉印膜上。
  5. 在TBST溶液中潤洗膜。
  6. 室溫條件下於一座搖動平台上使用1 - 2 ml/cm2的膜, 使用內含5%奶粉的TBST溶液阻斷。
  7. 室溫條件下於搖動平台上使用經過TBST-牛奶溶液適度稀釋的初級抗體孵育該膜1小時。(可使用恰合於印漬大小的容器最小化初級抗體的用量。)
  8. 在搖動平台上使用TBST清洗該膜2次, 每次10分鐘。
  9. 室溫條件下於搖動平台上使用經過TBST-牛奶溶液適度稀釋的次級抗體孵育該膜1小時。 (比色偵測法結合鹼性磷酸酶使用; 化學發光偵測法結合辣根過氧化酶使用)。
  10. 在搖動平台上使用TBST清洗該膜3次, 每次10分鐘。
  11. 比色偵測法
    A. 請於鹼性磷酸酶基質溶液中孵育膜直到色帶開始出現。
    B. 當色帶的顏色夠深時, 請於停止溶液中清洗印漬停止反應。
    C. 請於室溫條件下風亁印漬。
    D. 將印漬置於塑膠平板下並且拍照; 印漬會隨時間而褪色, 直接光照則會加速這個過程; 重新潤濕印漬將可以重新強化色帶。
  12. 化學發光偵測法

3. 附註

西方墨點法的靈敏度部份取決於從聚丙醯胺凝膠轉印到硝酸纖維素薄膜上的效率。一般而言, 凝膠越薄且所佔比例越低則轉印效率會好, 進而提升靈敏度。當蛋白質小於20 kDa時, 要使用 0.2 µm而非0.45 mm 的硝酸纖維素過濾膜。

非脂肪奶粉是一種優良的阻斷劑(blocking agent), 但也可以使用其它蛋白質, 例如酪蛋白、明膠、BSA以及卵白蛋白; 處理磷酸絲胺酸、磷酸酪胺酸以及磷酸酥胺酸時, 建議使用牛奶以外的阻斷劑, 因為牛奶含有許多磷蛋白會導致高背景。

所有清洗和孵育過程應搖動薄膜。

若有需要可於4°C條件下讓每一道清洗步驟隔夜進行。

若有需要可於4°C條件下讓阻斷隔夜進行。

每一道電泳藥物順序所對應的印漬條可使用刮鬍刀片剔除, 並且使用裝有不同抗體的獨立培養皿個別探測。

應以滴定方式決定初級和次級抗體的最佳濃度。

若基質溶液在4°C的儲存過程中出現沉澱, 請讓它回到室溫並混勻; 可以使用超音波水浴; 溶液中的少量沉澱物對產品的效果將不會產生危害; 基質溶液保持遠離開放火源, 避免與皮膚、眼睛以及嘴巴接觸。

可以使用西方墨點法的次細胞部份(subcellular fraction)來取得更好的效果, 例如膜接受器上的膜或者核酸蛋白質的核酸; 使用免疫親和色層分析或免疫沉澱法所得到的抗原濃度有助西方墨點法或得更明顯的色帶。

觀察被固定的蛋白質後, 可以將初級抗體從膜上剝離; 一個印漬可以剝除數次; 預測每次剝除過程所喪失的靈敏度:
• 剝除液: 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7(目錄編號 648310), 100 mM b-mercaptoethanol (目錄編號 444203), 2% SDS (目錄編號 428015或者428016)

 

 

 

 


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© Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 2014


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